科学研究的设计和方法中的科学性

上述研究结果，就不难看 出这种科研设计的局限性. 如果慢性乙型肝炎患者血清中HBV的拷贝数在1011拷贝 /mL，而且各株病毒间的序列都是不同的，那么在治疗前随机扩增、克隆、测序一 个克隆，仅仅代表的是该病毒株而已，与其他病毒无关，没有多少普遍的意义. 如 果治疗后，也是随机挑取一个病毒基因序列进行测定，也是同样的道理. 但是，治 疗前后研究同一个病毒的可能性只有1/108，换句话说这是不可能的. 因此，在治 疗前后，根本就是对于2株肯定不一样的病毒基因序列进行比较，这样的结果与治 疗的效应又有何干？因此，不能对于治疗前后各1个或少数的病毒基因序列进行测 定来研究抗病毒治疗前后病毒基因序列的改变，这种差别根本就不可能与治疗的效 应有关. 类似的例子还有很多. 有些有心人对于血清丙氨酸氨基转移(ALT)正常的HBV无 症状携带者(ASC)进行研究，观察病情变化过程中病毒基因序列的改变. 也是在AL T治疗前获取一个HBV基因克隆进行序列测定，在治疗后又获取一个克隆进行测序， 并且将ALT正常和ALT升高2个时间点的HBV基因序列进行比较，并且将这种差别，解 释为HBV感染者从ALT正常状态到ALT升高状态转变过程中的HBV基因序列的变化及其 规律，殊不知2次获得HBV病毒株根本就是不同的病毒，序列本来就不同，这样的比 较不但没有意义，还会误导HBV基因序列变化与病情变化之间相关性的研究. 如果 将HBV基因准种特点考虑进去，就不难理解这样的科研设计的局限性，就可以避免 类似的错误或不足之处. 因此，关于HBV准种研究的结果，尽管这一概念十分浅显 ，容易理解，但是对于我们认识HBV的存在状态，进行合理的科研设计，提高学术 论文的鉴赏水平，都具有十分重要的意义. 同样的道理，关于HCV和人免疫缺陷病 毒-1(HIV-1)的类似研究，也必须将病毒基因的准种特点考虑进去，事实上，关于 HBV准种特点的研究就是采用了在HCV、HIV-1的研究中所采用的准种概念. 研究病情变化前后，或者是研究治疗前后病毒基因序列的改变，应该将准种 特点考虑进去，因此不能通过单个或少数的几个克隆的序列分析进行判断[36-38] . 正确的做法是对于病毒的准种种群进行研究，从优势种群的漂变(shift)规律来 解释病毒基因序列的改变与病情变化和治疗疗效之间的关系. 由于病毒的准种特点 ，由于病毒的基因序列的异质性(heterogeneity)广泛存在，应用目前少数克隆的 序列分析技术是不可能解决的. 近年来基因芯片(DNA chips)这类高通量分析技术 的出现为研究这一课题提供了前所未有的机遇. 可以通过基因芯片的高通量研究， 对于HBV基因准种的特点进行研究，阐明HBV基因的变化与临床病情之间的相互关系 、与抗病毒治疗疗效之间的相互关系. 3 结合蛋白和受体的区别 利用配体蛋白分子进行筛选，一方面可能会得到受体蛋白分子，另一方面也会 得到蛋白结合蛋白. 如果只是发现一种配体蛋白结合的蛋白，还不足以肯定这种蛋 白就是配体蛋白的受体蛋白分子，还需要有另外的足够的研究证据，否则就会不完 整，就会导致错误的结论. 研究蛋白蛋白之间相互结合的技术相当多[39-51]. 研究细胞内蛋白与蛋白 质间的结合与相互作用的技术，主要有哺乳动物细胞双杂交、活细胞的激光共聚焦 显微技术、酵母双杂交技术等; 研究体外蛋白与蛋白之间相互作用的技术包括体外 免疫共沉淀技术、放射性配体分析技术、拖拉(pull down)技术等[52-59]. 作为受 体蛋白，必须具备与配体分子之间的结合，还必须具备跨膜的分布特征，与配体分 子结合以后介导信号转导过程. 配体分子与受体分子之间存在结合的现象，但是同 时也会存在与其他蛋白结合的现象. 因此，仅仅只有与配体分子结合的能力还不够 ，还必须阐明配体结合蛋白的分子结构与性质，才能决定配体蛋白结合的蛋白分子 究竟是否是受体分子. 如果明白这一点，就不会在仅仅证明有配体分子结合活性的 情况下，就匆匆断定这就是配体分子的受体分子. 这样的研究结果，必须具备重组 的实验证据，否则仅仅靠蛋白之间的这种结合就判定是配体的受体分子就显得证据 不足，可能会导致错误的结论. 我们利用酵母双杂交技术对于各种肝炎病毒的结构和非结构蛋白的结合蛋白 进行了系统的筛选，从理论上来讲，如果“诱饵”质粒表达的是肝炎病毒的包膜蛋 白，那么就有可能筛选得到肝炎病毒的特异性受体分子，因为筛选的惟一要求是在 酵母细胞中存在蛋白与蛋白之间的相互结合[60-66]. 但是，我们所筛选得到都是 结合蛋白，都不是受体蛋白，可见结合蛋白与受体蛋白之间的差别. 研究一种配体分子蛋白的受体的研究策略，可以参考发现HIV-1第二受体分 子的研究策略. 首先对于配体分子的细胞系通过流式细胞学技术进行分选、富集， 从这样的细胞系中分离纯化总mRNA，可以很好地保证受体蛋白编码基因的mRNA的丰 度. 然后应用这样的mRNA逆转录后建立真核细胞表达载体，转染不表达配体蛋白分 子的细胞系，然后利用配体分子与转染细胞系结合的磁珠细胞分离方法，富集配体 分子结合的转染细胞系，从中提取质粒DNA，以大肠杆菌扩增质粒，重复细胞转染 ，配体分子结合细胞的筛选等步骤，最终获得配体分子结合的受体分子结合蛋白编 码基因. 无论采用什么样的筛选技术和流程，最终的判断筛选分子是否是受体分子 ，在没有确定其分子结构及功能之前，任何草率的结论都是一种误导，应该特别小 心[67-69]. 现代分子生物学的理论和技术，极大地推动了现代肝脏病学的研究和进展. 同时也在不断地修正着我们对于肝脏病学的概念和理论. 在这一探索过程中，不 可避免地存在着一些偏差，甚至是错误[70-72]. 我们要勇于提出这些不足或者是 错误之处，只要我们认识到了错误或不足之处之所在，我们的认识就会提高一步， 我们的学科建设才会更快进步. 参考文献 1 成军.丙型肝炎病毒致病的分子生物学机制. 解放军医学杂志 2003;28:23- 27 2 成军. 新基因结构与功能研究的策略. 世界华人消化杂志 2003;11:373-37 7 3 成军.病毒性肝炎发病机制中的反式调节机制. 世界华人消化杂志 2003;11 :888-896 4 成军, 董菁, 洪源, 钟彦伟, 刘妍, 王刚, 王琳. 乙型肝炎病毒中国流行株 全基因的克隆与序列分析. 世界华人消化 杂志 2003;11:1083-1090 5 成军, 董菁.乙型肝炎病毒基因组结构与功能复杂性的新认识. 世界华人消化 杂志 2003;11:1073-1080 6 成军.病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略. 解放军医学杂志 2 003;28:757-761 7 成军.坚持相对稳定的科研方向是关键. 世界华人消化杂志 2003;11:18

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