猪链球菌的分离与鉴定

2．2  分离菌株的鉴定

2．2．1生化试验

    随机抽取上述分离菌血清肉汤培养物3#、8#、13#、15#，分别接种于蔗糖、山梨醇、棉实糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水杨苷、马尿酸钠培养基，37℃培养24h后，观察其对糖的利用情况。

2．2．2血清学鉴定

    将3#、8#、13#、15#菌经缓冲肉汤培养8h，通过3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，用Ph7.2 的0.01mol/L PBS制成    1*10 10~2*10 10细菌悬液。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细菌悬液对照及血清对照。

2．3 致病力及保护力试验

2．3．1菌落形成单位的测定  按常规方法进行[9]

2．3．2致病力试验

无菌吸取上述血清肉汤培养物 （含菌量5.0*10 8CFU/ml）以0.1ml /只、0.2ml/只、 0.3ml/只、 0.4ml /只、0.5ml/只分别腹腔注射小白鼠2只，观察其死亡时间和数量，测定其最小致死量。再将上述血清肉汤培养物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7 组。第一组，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二组每只注射8#菌0.2ml，第三组每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四组每只注射13#菌0.2ml，第五组每只注射15#菌0.2ml，第六组每只注射13#、15#菌各0.1ml，第七组每只注射无菌血清肉汤1.0ml。以上各组分别饲养观察其死亡时间及数量。

2．3．3保护力试验

    将3#、8#、13#、15#血清肉汤培养物分别接种于18  cm鲜血平板。37℃培养24h后，收菌，用麦氏比浊管比浊，适当稀释，然后用0.3%甲醛灭活；37℃作用24h；作无菌检验。然后分别腹部皮下接种小白鼠2只，0.4ml/ 只。10天后，再分别人工感染，0.2ml/只。

2．3．4细菌回收试验

    对致病力试验出现症状及死亡小白鼠剖检，并采集病料，进行分离。

2．4药敏试验 

    采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于9cm鲜血平板；待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，4℃2h使药物扩散，然后置37℃培养20—24h，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药。结果评定参照表1。

表 1    各种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准

抗菌药物名称
 抑菌圈直径（mm）
 
耐药
 中度敏感
 高度敏感
 
青霉素

土霉素

洁霉素

链霉素

庆大霉素

卡那霉素

头孢菌素
 <10

<10

<10

<10

<12

<12

<10
 10~12

10~14

10~14

10~14

13~14

13~14

10~15
 >13

>15

>15

>15

>15

>15

>15
 

3．结果

3．1分离细菌的培养特性及形态特征

3．1．1培养特性

    37℃培养24h后，所采的12份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的β溶血环。该菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

3．1．2染色特性  

    关节液、鲜血琼脂、匹克氏增菌液及血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列，在匹克氏增菌液及血清肉汤培养物中多呈长链状。

3．2生化试验结果（见表2）

        表2    分离菌生化试验结果

鉴定  蔗糖 山梨 棉实 葡萄 甘露  蕈糖 乳糖 菊糖 水杨 马尿

项目        醇   糖  

; 糖   糖                   苷  酸钠
 
3#     +    -    -    +     +     +    +    +    +    -

8#     +    -  &n

《猪链球菌的分离与鉴定(第2页)》